小鼠GV期卵母细胞发育潜能评价和GDNF对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育的影响

【摘要】卵母细胞作为雌性生殖细胞,为哺乳动物繁殖提供遗传物质基础,并支持着床前胚胎的发育。卵母细胞成熟质量直接决定了早期胚胎能否正常发育。卵母细胞质量评价标准的建立对体外胚胎发育的预测具有重要作用。在临床上,对于有排卵障碍的病例而言,生发泡(GerminalVesicle,GV)期卵母细胞的体外成熟、体外受精或单精注射是人类辅助生殖技术的重要组成部分,因此,筛选优良发育潜能的GV期卵母细胞是人类辅助生殖技术成功的前提。卵丘细胞层厚度(thicknessofcumuluslayers,C)、透明带厚度(thicknessofzonapellucida,Z)和带下间隙宽度(perivitellinespace,P)是卵母细胞形态学评价的三个重要参照物。然而,这三个形态学特征与GV期卵母细胞质量之间的关系还并未被广泛研究。本实验以小鼠为研究对象,对卵丘细胞层厚度、透明带厚度和带下间隙宽度进行分级,研究了这三个形态学特征与GV期卵母细胞质量的关系。更进一步,通过人为改变卵丘细胞层厚度、透明带厚度和带下间隙宽度,深入研究了这三个形态学指标作为评价卵母细胞发育潜能标准的可靠性。我们的研究结果表明：(1)带有三层及以上卵丘(C≥50μm)的卵母细胞具有较高的成熟率、受精率和胚胎发育率,人为去除部分卵丘虽不影响卵母细胞的体外成熟率,但影响了后期的受精率和胚胎发育率。(2)透明带厚度在5-8μm之间(5μm≤Z<8μm)的卵母细胞具有较高的成熟率,透明带厚度小于5μm(Z<5μm)的卵母细胞不能够正常成熟和受精。人为将透明带厚度从大于或等于8μm(Z≥8μm)变薄至5-8μm(5μm≤Z<8μm),虽然可以提高卵母细胞成熟率,但不能提高受精率和发育率。(3)较宽的带下间隙(P≥5μm)有利于卵母细胞极体的排放,但不利于卵母细胞的受精和胚胎发育。带下间隙小于1μm(P<1μm)的卵母细胞不能够成熟,即使人为扩大带下间隙,也不能够改善卵母细胞的发育潜能。我们的实验结果证明了GV期卵母细胞的卵丘细胞层厚度、透明带厚度和带下间隙厚度可以作为预测卵母细胞成熟、受精和胚胎发育潜力的指标,这些结果为人类辅助生殖提供参考数据,对提高人类辅助生殖成功率有重要意义。对于大多数哺乳动物而言,繁衍后代是生命周期中除个体生存之外最重要的生命活动。后代的繁衍起始于雌性动物卵母细胞生长、成熟、受精和早期胚胎发育。对于良种家畜例如牛和羊而言,人们常采用体外受精(InVitroFertilization,IVF)和胚胎移植(Embryotransfer,ET)技术进行扩繁,并且IVF-ET技术是动物转基因技术研究关键步骤之一。这一技术是以卵母细胞的体外成熟开始的,因此,卵母细胞成熟质量的好坏直接影响了后代的产出。卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中除内源性的基因表达与调控之外,外界信号分子也是影响其能否正常发育的重要调控方式之一。这种调控最常见也是最直接的方式之一就是通过旁分泌因子来发挥作用。GDNF是一种神经营养因子,最早是从大鼠胶质瘤细胞系上清液中分离出来的。研究发现它对小鼠、猪卵母细胞成熟、受精和早期阶段胚胎的发育起重要作用。因此,我们利用牛卵母细胞作为实验材料,研究了GDNF对成熟、受精和胚胎发育的作用。我们采用了免疫组化和免疫荧光方法,研究了GDNF在成熟卵泡、GV期卵母细胞、MII期卵母细胞和早期胚胎中的定位。卵母细胞成熟液和早期胚胎发育液中添加适量的GDNF因子对牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。用特异性的siRNA干扰受体GFRA1的表达量,统计牛卵母细胞成熟率。我们的结果表明,(1)牛GV期卵母细胞中未发现GDNF因子,只检测到它的受体；而卵母细胞成熟的其他时期和胚胎发育的各个时期中均检测到GDNF及它的受体信号。(2)添加适量的GDNF对卵母细胞成熟和早期胚胎发育具有促进作用。(3)干扰GFRA1的表达,导致牛卵母细胞成熟率显著低于对照组。我们的实验结果表明了GDNF促进卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育。
【作者】周红霞；
【导师】梁成光；
【作者基本信息】内蒙古大学，动物学，2014，硕士
【关键词】卵母细胞；卵丘细胞；透明带；带下间隙；卵母细胞成熟；胚胎发育；神经营养因子；神经营养因子受体α1；

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